Como preparar un fresco o muestra en fresco:

Lo primero que hay que tener en cuenta a la hora de hacer una preparación para una muestra en fresco, es conseguir unas heces recién excretadas, no podemos ir recogiendo por las jaulas heces de varias horas o de varios días, pues a los pocos minutos de la deposición comienza la replicación fúngica y bacteriana y esto nos puede dar una lectura no representativa de lo que el pájaro haya excretado……lo mas lógico es que hagamos una separación del pájaro a revisar, ya sea que este sano o sospechoso de enfermedad, a una jaula destinada para este uso, con la bandeja de fondo recién higienizada, o colocando un papel de aluminio en el fondo para poder recoger las heces recién excretadas.


Recogeremos las heces con una lanceta o mismamente con una cucharita de helado nueva o similar, ((en los supermercados podréis encontrar estos materiales embolsados y esterilizados)) y colocamos dos o tres cacas en un vial de los descritos anteriormente, y le añadimos aproximadamente el mismo volumen de agua destilada…….agitamos con energía hasta la total disolución de las heces y conseguir una mezcla homogénea.
Esta mezcla homogénea se podría filtrar para eliminar las trazas vegetales que nos pueden dificultar hacer una muestra fina para una observación optima, pero no lo aconsejo…….en mis comienzos filtraba todas las muestras, con un papel filtro con un paso de luz de 50 micras, pero posteriormente pude observar que a veces en el filtrado se pierden cosas, como seudohifas o hifas con medidas superiores a las 250micras de tamaño, así que si alguien quiere filtrar la mezcla debería utilizar un filtro al menos de medio milímetro 500 micras, para asegurarse que la observación es una buena representación de la muestra……. En los centros de menaje y grandes superficies podéis encontrar coladores de fibra sintética de pequeñísimo tamaño aptos para este trabajo y con un buen paso de luz.

Una vez terminada la preparación, aspiraremos el liquido del vial con una pipeta de plástico y goteamos en el porta objetos una pequeña cantidad, para posteriormente depositar un cubreobjetos encima de la muestra, procurando que este se ajuste y quede completamente plano en el porta objetos, y procurando también que el liquido de la muestra no sobrepase los limites del cubre, y así quedara lista para su observación.

La observación de este tipo de muestras en fresco, debería iniciarse con objetivos de bajo aumento, sobretodo si no se tiene experiencia en el manejo del micro, para acabar con el objetivo de 40X que es el objetivo optimo para la observación de este tipo de muestras.


Muestra en el vial



Muestra en el Porta


Muestra con cubre, lista para su observación




Preparación de una muestra para tinción de Gram


Para la preparación de la muestra a teñir, se sigue el procedimiento arriba explicado con la excepción de que no le colocaremos el cubre, y en su lugar lo que haremos será extender con la punta de la pipeta empleada el contenido de la muestra sobre el porta, abarcando una extensión de dos a tres centímetros, y la dejamos secar al aire, o ayudandonos con un mechero de laboratorio, o simplemente con el calor de la llama de una vela, a una distancia de 15cm sobre la llama procurando que la muestra no llegue nunca hervir ni a emitir vapores o que se deteriore por el efecto calor.

Yo particularmente les dejo secar al aire o me ayudo del calor del ruter-adsl, o aprovecho el calor de un radiador de calefacción……..una vez la muestra este bien seca y bien fijada, procedemos a la tinción de Gram.

Paso 1º……..Cubrimos la superficie de la muestra con Violeta Cristal y la dejamos reposar un minuto ((es interesante que nos coloquemos en el habitaculo de trabajo un reloj de cocina con segundero))…..pasado este minuto lavamos la muestra con el dispensador de chorro, con cuidado de que el chorro no golpee la muestra directamente, después escurrimos el agua sobrante del porta y la muestra

Paso 2º…….Cubrimos la muestra con el segundo reactivo, Lugol, y la dejamos reposar de nuevo también un minuto……pasado este tiempo volvemos a lavar la muestra, y escurrimos el agua sobrante.

Paso 3…… Cubrimos la muestra con el decolorante, haciendo leves agitaciones manuales, hasta la eliminación del Violeta, después volvemos a lavar con agua ayudados del dispensador y eliminamos el agua sobrante de la muestra.

El tiempo de acción del decolorante dependerá del grueso de nuestra muestra, hay que conseguir una muestra fina y bien extendida, pero en el peor de los casos bastara con 5 o 6 segundos.

Paso 4º……Aplicamos el ultimo reactivo que es que es la safranina durante un minuto, y volvemos a lavar la muestra con chorro de agua sin dañarla ni desprenderla, dejamos secar al aire o ayudados por una fuente de calor leve, y cuando se evapore por completo la humedad estará lista para su observación.

Observación de la muestra teñida

Situamos la muestra en una superficie plana, y le depositamos una gota de aceite de inmersión en el centro de la muestra, la colocamos en la pinza del carro de cruz del micro y preparamos el objetivo de X100 para observarla.

Muestra Extendida y seca, preparada para la tinción


Muestra tiñiendo en la cubeta


Muestra teñida con protocolo Gram


Muestra teñida y con gota de aceite de inmersión lista para la observacion


Foto de la observacion de la muestra real que ha servido de ejemplo, como podeis ver algunas bacterias se tiñen de azul(( cocos sp.)) y otras de rojo o rosa ((bacilos sp)) las bacterias que tiñen de azul se les llaman Gram+ y las que tiñen de rojo o rosa Gram-



Bueno los enlaces son ejemplos de donde podeis conseguir material......hay muchas casas que venden este tipo de material, algunas venden al publico en general, otras solo a profesionales, hay que llamar y preguntar, el ultimo enlace es para los reactivos......saludos


http://www.labotienda.com/es/catalogo/h ... jetos.aspx

Ojo la medida de los cubres, deberia de ser d 24x24

http://www.labotienda.com/es/catalogo/h ... jetos.aspx



http://www.labotienda.com/es/catalogo/L ... b-500.aspx


Las pipetas que mejor se adaptan a lo nuestro son las de 3ml

http://www.labotienda.com/es/catalogo/p ... dores.aspx



http://www.labotienda.com/es/catalogo/v ... nsayo.aspx

Ojo!!A la hora de elegir los viales han de coincidir con la medida de los tapones, luego no tiene solucion.


http://www.labotienda.com/es/catalogo/P ... mm-(b-1000)-verde.aspx


http://www.materlab.com/veterinaria_micro_soluc.htm

Bueno Alchemy ya se ha puesto al tajo y ha inaugurado este apartado con un excelente post del maestro Salobreña sobre la preparacion de un freco o muestra en fresco.

Gracias Alchemy y como no al maestro Salobreña.

Saludos.

chapeu,si señor, mejor explicado imposible.
muchas gracias y felicitarnos x tenerte aqui salobreña,un saludo.

Mi mas sincera enhorabuena Salobreña. Gracias por tomarse la molestia de semejante post, para quitarse el sombrero. Un saludo.

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Buenos dias!

Hace mucho del ultimo mensaje! pero no queria dejar pasar la excelencia en la preparacion de las muestras!! Los preparados que hiciste, tienen muy buena resolucion!!!

te felicito y muchas gracias por compartirlo!

Saludos

Guido
Argentina

Tienes razon Guido, en este foro tenemos la suerte de contar con la "excelencia" del maestro Salobreña, todo un crak.

Saludos